□ 누에를 이용한 사료첨가용 천연항생제 생산 기술 개발

1. 연구배경과 필요성

○ 우리나라 양잠산업의 규모는 1976년을 정점으로 지속적으로 감소하고 있으며, 현재는 누에분말이나 동충하초 등 기능성 양잠산물 생산으로 전환해 잠업을 유지하고 있는 실정이다.

○ 이에, 양잠산업의 규모를 확대하고 새로운 부가가치 창출을 위해서는 소비처가 한정된 기능성 식품원료 생산 외에도 가축 사료첨가제와 같은 새로운 시장 개척이 필요하다.

○ 누에는 식약청으로부터 기능성 식품의 원료로 인정받아 인간과 가축에 매우 안전하며, 각종 유용단백질을 다량 함유하고 있어 가축의 성장촉진용 사료첨가제로 활용 가능하다.

○ 또한, 누에는 병원균 침입 시 선천성 면역반응을 통해 강력한 항균펩타이드를 생산해 방어하는 기작을 보유하고 있어 이를 이용하면 항생제 대체제로 개발이 가능할 것이다.

○ 한편, 2011년 7월에 가축사료 내 배합사료 제조용 항생제 사용이 전면 금지됨에 따라 경제성과 효과 등을 고려한 새로운 천연항생제 개발이 시급한 실정이다.

○ 따라서, 누에를 활용한 가축 사료첨가용 항생제 대체제 개발을 목적으로 인체와 가축에 유익한 유산균으로부터 면역유도제를 제조해 누에 생체 내 항균펩타이드 생산을 유도하는 기술을 개발하고, 이를 기반으로 닭 생산성을 높일 수 있는 사료첨가용 누에 분말 천연항생제 개발을 통해 양계농가의 수익증대뿐 만 아니라 양잠농가의 소득증대와 양잠산업의 발전에 기여하고자 한다.

2. 유산균 펩티도글리칸이 함유된 누에 면역유도제 개발

○ 누에를 포함한 곤충은 병원성 미생물 침입에 대한 강력한 방어 시스템을 보유하고 있어 천연항생제로 개발 가능하다.

- 누에는 선천성 면역체제에서 세포성 면역반응에 의해 체내로 침입한 병원균을 인식하고 신속히 이들 병원균을 제거하기 위한 강력한 항균성 단백질들을 합성해 대응한다.

- 따라서 병원균과 세포벽 성분을 누에 생체 내로 인위적으로 주입하면 세포성 면역반응이 활성화돼 세크로핀과 같은 항균펩타이드를 유도 합성할 수 있어 천연항생제로 누에를 이용할 수 있다.

- 하지만 이들 면역반응 활성 인자들은 가축의 세균성 질병 유발, 페혈증과 같은 심각한 부작용을 초래할 수 있다.

- 이러한 문제점을 해결하기 위해서 병원성 세균과 유사한 세포벽 성분을 지닌 그람양성균인 유산균을 이용해 누에 면역유도제를 개발했다.

○ 인체와 동물에 안전하고 패혈증을 유발하지 않는 유산균(Lactobacillus plantarum)으로부터 세포막 성분인 펩티도글리칸(PG, Peptidoglycan)을 추출해 누에 면역유도제를 제조했다.

○ 유산균 펩티도글리칸이 함유된 누에 면역유도제 제작과정은 다음과 같다.

- 1단계: 초음파분해(sonication)와 부탄올 추출을 통해 펩티도글리칸이 포함된 유산균 세포벽 추출물 제조

- 2단계: 투석과 동결건조로 유산균 세포벽 추출물 분말 제작

- 3단계: 멸균된 식염수에 녹여 수용성 누에 면역유도용 주사제 제작

※ 펩티도글리칸(PG, Peptidoglycan)이란?

○ 세균의 세포벽을 구성하는 주요 성분으로 다당사슬에 짧은 펩티드사슬이 규칙적으로 결합한 화합물로 그람양성균에서는 세포질막 바깥쪽으로 여러 층의 펩티도글리칸 층이 결합된 구조로 돼 있으며 세포 건조 무게의 약 90 %를 차지하고 있다.

○ 펩티도글리칸은 아세틸화된 두 가지 아미노당인 N-아세틸글루코사민, N-아세틸뮤람산과 L-알라닌, D-알라닌, D-글루탐산, 라이신이나 디아미노피멜산과 같은 아미노산으로 구성돼 있다.

○ 곤충의 선천성 면역반응에서 면역 활성화 물질로 알려져 있다.

3. 누에 면역유도제 주사접종에 의한 누에 분말 천연항생제 생산

○ 유산균 펩티도글리칸이 함유된 면역유도제(0.05ml)를 누에 배면을 통해 체강에 주사 접종해 면역을 활성화했다.

- 면역 활성화 이후 대장균을 대상으로 항균활성을 검정한 결과, 일반누에에 비해 높은 항균활성을 나타냄을 확인했다.

누에 면역유도제 주사 접종	항균활성 비교 검정

○ 최적의 누에 면역 활성화를 위한 면역유도제의 농도와 유도시간

- 10ppm(10mg/L)의 주사농도에서 항균활성이 생균 주사에 비해 약 4.9배 높았으며 50ppm, 20ppm, 그람음성균의 세포벽 성분인 LPS 50ppm와 유사한 항균활성을 나타냈었다.

- 또한 면역유도제 주사 접종 후 18시간 동안 유도된 시료에서 가장 높은 항균활성을 나타냈었다.

면역유도제 농도별 항균력 검정	면역유도 시간별 항균력 검정

※ 항균력 검정: 대장균을 대상으로 방사선확산분석법(Radial diffusion assay)에 따라 고체상 배지에서의 균 생육이 저해된 영역의 크기를 바탕으로 항균활성도(Units)를 측정(1mm=10U).

○ 이상의 조건을 바탕으로 누에 분말 천연항생제 대량생산

- 뽕잎으로 사육된 5령 5일째 누에를 10~15분 동안 냉수에 침수시켜 비활성화한 다음 10ppm 농도의 면역유도제 0.05ml를 체강에 주사 접종을 통해 면역화했다.

- 주사 접종한 누에는 18~20시간 동안 면역을 활성화시킨 후 60 ℃에서 24시간 동안 열풍 건조를 통해 누에 분말 천연항생제를 생산했다.

누에 주사접종과 면역 활성화	면역유도 누에 항균활성 검정

○ 개발된 사료첨가용 누에 분말 천연항생제

4. 가금 주요 병원균에 대한 누에 분말 천연항생제의 항균활성

○ 살모넬라균(S. enteritidis)에 대한 항균활성

○ 대장균(E. coli)에 대한 항균활성

5. 누에 분말 천연항생제의 세포 안전성

○ 소장 유래 세포인 Caco-2와 섬유모세포인 L929 세포주를 대상으로 누에 분말 천연항생제 추출물 농도별 처리에 따른 세포 증식률을 조사해 세포독성을 검정했다.

○ 누에 분말 천연항생제 추출물은 높은 처리농도(10,000ppm)에서도 해당 세포에 대한 독성이 없으며, 오히려 소장 세포인 Caco-2에서는 대조구에 비해 3배 이상 증식을 유도하는 것으로 확인됐다.

Caco-2 세포 증식률(72시간)	L929 세포 증식률(72시간)

6. 누에 자동 주사장치 개발

○ 현재 누에 분말 천연항생제 생산의 효율성 증대와 비용 절감을 위해 누에 자동화 주사 장치를 개발 중에 있다.

현재 개발 추진 중인 누에 자동 주사장치

□ 누에 분말 천연항생제 급여 효과

1. 육계 생산성 비교

○ 5주 동안 첨가 급여 시 무항생제 대비 체중 증가, 사료섭취량 감소

- 0.01 % 첨가: 체중 3.7 % 증가, 사료요구율 4.5 % 개선

- 0.05 % 첨가: 체중 5.2 % 증가, 사료요구율 6.2 % 개선

5주 종료 체중(g/수)	※사료요구율(사료섭취량/증체량)

※ 처리구당 30수x4반복=120수

※ 사료요구율: 체중 1kg 증가를 위해 필요한 사료량.

2. 맹장 내 미생물 비교

○ 맹장 내 대장균과 살모넬라가 무항생제 대비 감소

- 0.01 % 첨가: 대장균 4.4 %, 살모넬라균 9.7 % 감소

- 0.05 % 첨가: 대장균 5.5 %, 살모넬라균 15.6 % 감소

대장균 수(log10 CFU/g)	살모넬라균 수(log10 CFU/g)

3. 혈액 내 대사물 비교

○ 간과 신장 손상 시 증가하는 혈액생리 지표 무항생제 대비 감소

- 0.01 % 첨가: AST 10.4 %, 총단백질 2.7 % 감소

- 0.05 % 첨가: AST 8.8 % 감소, 총단백질 유의성 없음

총단백질(mg/dL)	AST(U/L)

※ 총단백질: 혈액 내 알부민과 글로불린을 합친 것으로 질병 감염이나 염증 발생 시 글로불린 증가로 총단백질이 증가함.

※ AST(아스파라긴산 아미노전이효소, aspartate aminoreansferase): 간과 신장 세포에 존재하는 효소로 질병, 염증 등으로 세포가 손상, 파괴되면 이들 효소가 혈액 내로 유출되어 증가하게 때문에 간과 신장 손상 지표로 이용

4. 혈액 내 항산화와 스트레스 관련 인자 비교

○ 무항생제 대비 항산화 활성 증가, 스트레스 감소

- 0.01 % 첨가: 총 항산화 활성 1.38 % 증가, 코티졸 함량 37.2 % 감소

- 0.05 % 첨가: 총 항산화 활성 1.86 % 증가, 코티졸 함량 41.8 % 감소

총항산화활성(mM TEAC/mL)	코티졸(ng/mL)

※ 코티졸(Cortisol): 대표적인 스트레스 호르몬으로 외부 환경 변화와 질병 유입 시 급속히 상승해 체내 면역반응 증진, 항상성 유지 등의 역할을 하나, 지속적으로 높은 수준으로 유지될 경우 건강에 악영향을 미침.

5. 경제성 분석

○ 육계 5만수 사육 농가에서 누에 분말 천연항생제 0.01 %를 사료에 첨가해 급여할 경우, 연간 약 3,150만 원 수익 증대

손실적 요소(A)	이익적 요소(B)
○ 사료첨가제 비용 추가: 38원 - 누에 분말 0.01 % 첨가 비용 발생 ․3.812kg(사료섭취량)×0.01 %×100,000원1=38원	○ 닭고기 판매수익 증가: 117원 - 증체량 증가로 닭고기 판매수익 증가 ․(2.280kg-2.202kg)×1,500원2=117원 ○ 사료비 절감 : 26원 - 사료섭취량 감소로 사료비 절감 ․(3.813kg-3.856kg)×600원*=26원 ○ 계 : 117원+26원=143원
○ 추정 수익액(B-A)= 105원(143원-38원)

1 누에분말 천연항생제 가격: 100,000원/kg.

2 닭고기 산지가격: 1,500원/생체 kg.

3 육계사료 구입가격: 600원/kg.

※ 육계 50,000수 6회전 사육 시: 105원×50,000수×6회전: 31,500,000원.

○ 반면에 0.05 %를 사료에 첨가해 급여할 경우, 누에 분말 비용 증가로 인해 수익 감소: 연간 약 120만 원 수익 증대

손실적 요소(A)	이익적 요소(B)
○ 사료첨가제 비용 추가 : 191원 - 누에 분말 0.05% 첨가 비용 발생 ․3.810kg(사료섭취량)×0.05%×100,000원1=191원	○ 닭고기 판매수익 증가 : 167원 - 증체량 증가로 닭고기 판매수익 증가 ․(2.313kg-2.202kg)×1,500원2=167원 ○ 사료비 절감 : 28원 - 사료섭취량 감소로 사료비 절감 ․(3.810kg-3.856kg)×600원*=28원 ○ 계 : 167원+28원=195원
○ 추정 수익액(B-A)= 4원(195원-191원)

1 누에분말 천연항생제 가격: 100,000원/kg.

2 닭고기 산지가격: 1,500원/생체 kg.

3 육계사료 구입가격: 600원/kg.

※ 육계 50,000수 6회전 사육 시: 4원×50,000수×6회전: 1,200,000원.

Q1	누에를 사료첨가제로 개발하게 된 배경은 무엇인가요?

○ 누에는 식약청으로부터 기능성 식품의 원료로 인정받을 정도로 인간과 가축에 매우 안전하고 각종 유용단백질을 다량 함유하고 있어 가축의 성장촉진에 유용한 소재로 이용 가능할 것으로 인식돼 왔습니다.

○ 또한, 누에는 병원균 침입 시 면역 활성화를 통해 체내에 강력한 항균성 펩타이드를 생산해 방어하는 시스템을 보유하고 있어 이를 이용하면 천연항생제로 개발이 쉽습니다.

○ 한편, 2011년 7월 1일부터 사료첨가용 항생제 사용이 전면 금지됐고, 기존 항생제를 대체할 새로운 천연항생제 개발 필요성이 강조되고 있습니다.

○ 이에 따라 누에 면역반응 유도 기술을 이용해 닭의 스트레스를 낮추고 면역력과 생산성을 높일 수 있는 누에 분말 천연항생제를 개발했습니다.

Q2	누에 분말 천연항생제는 어떻게 생산하나요?

○ 누에 분말 천연항생제를 제작하기 위해서는 누에 자체의 면역체계를 활성화시켜 항균펩타이드 생산을 유도할 수 있는 면역유도제가 필요합니다.

○ 농촌진흥청은 인체와 가축에 유익한 유산균으로부터 세포벽 성분인 펩티도글리칸을 추출해 면역유도제를 제조했고, 이를 이용한 면역반응 유도 기술을 개발해 항균 활성이 우수한 누에 분말 천연항생제를 생산했습니다.

Q3	누에 면역반응 유도 기술의 특징은 무엇인가요?

○ 누에는 병원균이 체내로 침입하면 선천성 면역반응에 의해서 신속히 이들 병원균을 제거하기 위한 강력한 항균펩타이드를 생산해 대응합니다.

○ 이러한 면역반응을 이용해 인위적으로 병원균과 이들 세포벽 성분을 체내에 주입하면 세포성 면역반응이 활성화돼 세크로핀과 같은 항균펩타이드 생산을 유도할 수 있어 천연항생제로써 누에를 이용 할 수 있습니다.

○ 하지만 이들 면역반응 활성 인자들은 가축의 세균성 질병 유발과 페혈증과 같은 심각한 부작용을 초래할 수 있습니다.

○ 이번에 개발한 누에 면역반응 유도 기술에서는 이러한 문제점을 해결하기 위해서 병원성 세균과 유사한 세포벽 성분을 지니고 있는 그람양성균인 유산균에서 세포벽 성분인 펩티도글리칸을 추출해 보다 안전한 면역유도제를 제작해 사용했습니다.

Q4	펩티도글리칸은 무엇인가요?

○ 펩티도글리칸(PG, Peptidoglycan)은 세균의 세포벽을 구성하는 화합물로 내부압력과 삼투압으로부터 세포를 보호하고 세포의 골격을 형성하는 역할을 합니다. 아세틸화된 아미노당인 N-아세틸글루코사민, N-아세틸뮤람산과 L-알라닌, D-알라닌, D-글루탐산, 라이신이나 디아미노피멜산과 같은 아미노산으로 구성돼 있습니다. 그람양성균에서는 여러 개의 펩티도글리칸 층이 세포막 바깥쪽으로 두껍게 감싸고 있으며 세포 건조 무게의 약 90 %를 차지하고 있습니다. 펩티도글리칸은 곤충의 체내에서 면역반응을 활성화하는 것으로 알려져 있습니다.

Q5	이번에 개발한 누에 분말 천연항생제는 어떤 효과를 갖나요?

○ 누에 분말 천연항생제는 육계의 생산성 향상, 장내 병원성 세균 감소, 건강 증진, 체내 항산화력 증진, 스트레스 감소 등 효과를 나타냈습니다.

○ 효과를 구체적으로 말씀드리면, 누에 분말 천연항생제 0.01 %를 사료에 첨가 급여한 경우 무항생제 대비 5주 체중은 3.7 %, 사료요구율은 4.5 % 개선돼 육계 수당 105원의 수익이 발생하는 것으로 조사됐습니다. 육계 5만수 규모로 연간 6회 사육하는 농가의 경우 3,150만 원 정도의 수익 증대 효과가 있는 것으로 분석됐습니다.

○ 맹장 내 미생물 조사에서는 질병과 위장관 손상에 관련 있는 살모넬라, 대장균이 무항생제 대비 각각 9.7 %, 4.4 % 감소했습니다.

○ 간과 신장 손상 시 증가하는 혈액 생리 지표인 총단백질, 아스파라긴산 아미노전이효소(AST, aspartate aminoreansferase)는 무항생제 대비 2.7 %, 10.4 %씩 감소시켰습니다.

○ 이밖에도 혈액 총항산화력은 1.4 % 증가했으며, 대표적인 스트레스 호르몬의 하나인 코티졸(Cortisol) 함량은 37.2 % 감소했습니다.

Q6	양잠농가에는 무엇이 좋은가요?

○ 현재 누에 분말이 기능성 식품으로 인정돼 농가의 고소득 작목으로 인식되고 있으나 한정된 소비처로 인해 생산량 확대의 한계에 직면하고 있습니다. 따라서 이번에 누에를 이용한 사료첨가제 개발로 새로운 시장을 확보함으로써 양잠산업의 규모를 확대하고 양잠농가의 소득향상에 크게 기여할 것으로 기대됩니다.

○ 누에 분말 천연항생제는 5령 5일 누에(건조무게: 13kg/상자)를 대상으로 생산되기 때문에 기존의 누에 가루를 생산하는 5령 3일 누에(8kg/상자)보다 약 60 % 이상 중량이 증가함으로써 양잠농가의 소득이 크게 향상될 것으로 기대됩니다.

Q7	앞으로 계획은 무엇인가요?

○ 이번에 개발한 천연항생제 생산 누에 분말 제조 기술은 2013년 6월에 ‘누에 면역반응 유도용 조성물 및 이에 의해 면역이 유도돼 항균활성이 부가된 누에‘라는 명칭으로 특허 출원(출원번호:10-2013-0072203)을 했으며, 앞으로 산업체에 기술 이전하여 2015년 까지 제품화 할 수 있도록 하겠습니다.

○ 또한 농촌진흥청은 관련 부처, 산업체와 협력해 누에 분말 천연항생제가 육계는 물론 산란계와 오리 농가에 확대 보급되도록 노력하겠습니다.

○ 앞으로도 누에를 활용한 기능성 소재 개발을 통해 양잠산업 규모 확대와 획기적인 농가 소득 증대를 도모할 수 있도록 최선의 노력을 다할 것입니다.